前面的上楼都说了。如果自己觉得引物设计没有问题，那么可以做退火温度梯度长升高，这样一般会有好的效果，我们一般的rt-pcr引物都用60度来退火。
一般引物设计时，要保证有12-15个碱基和模板完全匹配。而且引物的3‘端不能与其他位置配对，不能被封闭，最多封闭3个碱基。上游引物，下游引物，和他们之间尽量减少二聚体。保证gc含量在45-55之间。还有很多设计原则都是可以查到的。
而实际上，如果是从质粒上扩增一段序列，我一般保证12个左右配对，加上酶切位点，保护碱基。只要引物3’端不被封闭3个碱基，引物就可以用。pcr时也不用算退火温度，60度就可以，特异性和产量都没问题。
你可以提高一下退火温度再试试。应该就可以减少非特异性条带了